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作者整合了TCGA的肿瘤样本和GTEx数据库的正常样本，以确定Siglec-15 mRNA表达特征。总体而言，Siglec-15在大多数癌症类型中上调，如乳腺浸润性癌（BRCA）、胆管癌（CHOL）、结直肠腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、胶质母细胞瘤（GBM）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肾嗜酸性染色体瘤（KICH）、急性髓系白血病（LAML）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）、直肠癌（READ）、皮肤切除性黑素瘤（SKCM）、胃腺癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）、子宫内膜癌（UCEC）和子宫肉瘤（UCS）（图1a）。当仅包括TCGA中的肿瘤和相邻组织时，发现Siglec-15在COAD、HNSC、KICH、KIRP、LUAD、READ、SKCM的转移组织、THCA和UCEC中上调。通过TIMER数据库，Siglec-15在前列腺癌（PRAD）中下调（附图S1a）。使用Oncomine，发现Siglec-15在膀胱癌、脑部和中枢神经系统（CNS）癌症、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肾癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌和肉瘤中过度表达，但在胃癌和胰腺癌中表达不足（附图S1b）。
在不同的人类癌症中，Siglec-15的CNA和DNA甲基化改变
遗传和表观遗传变化在调控癌症发展和免疫耐受中起着关键作用。使用cBioPortal进一步探索了Siglec-15的遗传变化。作者发现，在卵巢癌（OV）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肉瘤（SARC）、子宫内膜癌（UCEC）、膀胱癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、黑色素瘤（SKCM）和淋巴组织肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）中，高Siglec-15表达的患者伴随着基因变异（图2a，补充图S2a）。Siglec-15遗传变异的趋势与这些癌症中的mRNA水平一致。为了探索CNA贡献的基因表达变异，作者分析了基因表达与相对线性拷贝数值之间的关系。结果显示，在结直肠癌（COAD）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、卵巢癌（OV）、胃癌（STAD）、睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）和子宫内膜癌（UCEC）中，Siglec-15表达与CNA呈正相关，但在肉瘤（SARC）和胰腺癌（PAAD）中观察到负相关（图2b）。在其他癌症中未发现Siglec-15表达与CNA之间的关联（补充图S2b）。然而，在其他癌症中，包括肺腺癌（LUAD）、宫颈癌（CESC）、结直肠癌（COAD）、肾盂癌（KIRP）、直肠癌（READ）和肾癌（KIRC），无法合理解释Siglec-15的表达变化。然后，作者确定了表观遗传机制是否在调控Siglec-15 mRNA表达中起作用。DNA甲基化是一种表观遗传机制，可以在不改变基因组序列的情况下控制基因表达。为了将启动子DNA甲基化水平与Siglec-15表达联系起来，作者在DNA甲基化状态和Siglec-15表达之间进行了相关性分析（图2c）。在甲状腺乳头状癌（THCA）、膀胱癌（BLCA）、子宫内膜癌（UCEC）、肉瘤（SARC）、生殖细胞肿瘤（TGCT）、胸腺瘤（THYM）、乳腺癌（BRCA）、子宫颈肉瘤（UCS）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、肝细胞癌（LIHC）、胃癌（STAD）、胰腺导管腺癌（PAAD）中发现DNA甲基化与Siglec-15表达呈显著负相关（-1 < Pearson r < -0.3，图2c），在子宫颈鳞状细胞癌（CESC）、结肠癌（COAD）、肾母细胞瘤（KICH）、肾小管细胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）、嗜铬细胞瘤（PCPG）、前列腺癌（PRAD）和直肠癌（READ）中也发现了负相关（-0.3 < Pearson r < -0.1，补充图S3a）。在其他癌症中未发现Siglec-15表达与DNA甲基化的关联（补充图S3b）。然后，作者使用UALCAN研究了癌症和相邻正常组织中Siglec-15启动子DNA甲基化状态的差异（图2d）。在肺腺癌（LUAD）、子宫颈鳞状细胞癌（CESC）、结肠癌（COAD）、肾小管细胞癌（KIRP）、直肠癌（READ）和肾透明细胞癌（KIRC）组织中，Siglec-15的DNA甲基化水平较相邻正常组织低。因此，一些癌症中Siglec-15 mRNA表达的异常增加很可能是基因改变和较低的DNA甲基化水平的结果。
Siglec-15 mRNA表达与预后价值的相关性分析
在探索Siglec-15在DNA和mRNA水平上的表达特征后，作者使用Kaplan-Meier绘图法研究了异常Siglec-15 mRNA表达对预后的影响。作者的结果显示，Siglec-15在不同类型的癌症中具有不同的预后价值（图3）。在TCGA数据中，上调的Siglec-15表达与BLCA、BRCA、HNSC、THCA和UCEC的较长生存期（OS）以及BRCA、LIHC、OV和UCEC的较长无复发生存期（RFS）相关（图3a）。相反，上调的Siglec-15表达与KIRC、PAAD和SARC的较短OS以及PAAD和SARC的较短RFS相关（图3b）。Siglec-15在其他癌症中没有显示出预后价值（附图S4）。除了TCGA外，作者还分析了来自GEO和其他项目的ChIP和RNAseq数据，以获取不同癌症亚型的生存信息。作者发现，Siglec-15的高mRNA表达预示着BRCA-luminal A、BRCA-luminal B、OV和STAD-diffuse的较好预后（图3c）。高Siglec-15表达在BRCA-luminal A中预示着良好的总生存期（OS）、无复发生存期（RFS）、疾病进展后生存期（PPS）和远处转移无病生存期（DMFS）；在BRCA-luminal B中预示着良好的OS和RFS；在OV-serous中预示着良好的OS和PFS；在STAD-diffuse中预示着良好的首次进展（FP）。高Siglec-15表达预测LUAD、BRCA-basal、BRCA-Her2+和STAD的不良预后（图3d）。此外，高Siglec-15表达与LUAD中的不良OS和FP相关；与BRCA-basal中的不良OS相关；与BRCA-Her2+中的不良RFS相关；与STAD-intestinal中的不良OS和PPS相关；与STAD-mixed中的不良OS相关。令人意外的是，高Siglec-15表达预测BRCA-basal中的良好RFS。Siglec-15表达在不同的BRCA或STAD亚型中具有相反的预后意义，这可能是由于其不同的免疫浸润特性所致。从Kaplan-Meier plotter中可以看出，Siglec-15 mRNA表达与其他癌症的预后没有显著相关性（附图S5）。
Siglec-15的mRNA表达与肿瘤免疫微环境之间的关系
在确定Siglec-15的预后价值之后，作者探讨了Siglec-15与肿瘤浸润免疫细胞在癌症中的关系（图4a）。首先，作者通过CIBERSORT算法评估了TCGA中33种癌症的免疫微环境成分。根据Siglec-15与免疫细胞之间的关系进行的聚类热图显示，在几种癌症中，尤其是食管鳞状细胞癌（Spearman r = 0.31，p = .0002）和睾丸生殖细胞肿瘤（Spearman r = 0.59，p = 3.77E-15），Siglec-15与调节性T细胞（Tregs）呈正相关。大多数与巨噬细胞的相关性是正的。然而，在膀胱癌（BLCA）和肾上腺皮质癌（ACC）中，Siglec-15与巨噬细胞呈负相关。由于其抑制T细胞的功能，作者重点关注Siglec-15与CD8 + T细胞之间的关系。Siglec-15与ACC中的CD8 + T细胞呈正相关，而与BRCA-basal、甲状腺乳头状癌（THCA）和子宫颈肥大细胞病（UCS）中的CD8 + T细胞呈负相关。需要注意的是，Siglec-15与免疫细胞之间的关系在不同的乳腺癌亚型中具有多样的功能。在BRCA-basal亚型中，Siglec-15与滤泡辅助T细胞呈负相关（Spearman r = -0.37，p = 5.74E-07），与活化的NK细胞、活化的树突状细胞（DCs）和CD8 + T细胞呈负相关。然而，在其他BRCA亚型中，Siglec-15与免疫细胞之间没有相关性。此外，在COAD、LIHC、PAAD、READ、STAD、THCA和UCEC中，免疫细胞的组成与Siglec-15之间没有显著相关性。
为了进一步研究Siglec-15的潜在功能，作者在多种癌症类型中进行了KEGG和GO GSEA分析（图5a）。热图显示了KEGG分析的明显聚类模式（NES ≥ 1.0，FDR < 0.25）。免疫相关通路在许多癌症中高度富集，如睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）、肉瘤（SARC）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、前列腺癌（PRAD）、胃癌（STAD）、低级别胶质母细胞瘤（LGG）、甲状腺癌（THCA）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、胶质母细胞瘤（GBM）、肾透明细胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）和黑色素瘤（SKCM）。Siglec-15在“趋化因子信号通路”、“JAK-STAT信号通路”、“NF-kappa B信号通路”、“Toll样受体信号通路”、“T细胞受体信号通路”、“自然杀伤细胞介导的细胞毒作用”、“B细胞受体信号通路”和“TNF信号通路”中显著参与。它还影响了几个与癌症相关的通路，包括“PI3K-Akt信号通路”、“MAPK信号通路”、“VEGF信号通路”和“凋亡”通路。Siglec-15在几种癌症中影响了“代谢通路”、“mTOR信号通路”和“HIF-1信号通路”。有趣的是，Siglec-15抑制了上述大多数通路，而在膀胱癌（BLCA）中激活了一些通路，如“代谢通路”。附加细节可在附表S3中找到。
为了验证上述结果，作者重点关注了LUAD中Siglec-15的表达、预后价值、与免疫细胞的关系以及相关通路，并使用从天津医科大学癌症研究所和医院收集的组织样本进行了体外实验。作者首先通过RT-qPCR对20对匹配的LUAD组织样本评估了Siglec-15的表达。结果显示，Siglec-15在原发肿瘤组织中显著上调（p = .0266）（图6a）。如上所述，Siglec-15与KEGG中的“趋化因子信号通路”和“细胞因子-细胞因子受体相互作用”以及LUAD中的GO术语“细胞因子产生”和“细胞因子产生调节”相关联（图6b）。作者重点关注了“趋化因子信号通路”（附图S6a），并使用20个LUAD组织样本通过RT-qPCR进行验证（图6c）。趋化因子信号通路（CXCR3、GNAI2、RAC2和MMP9）以及下游的PI3 K-AKT信号通路（AKT3、LPAR6和CDK6）的基因表达显示出与Siglec-15呈正相关的趋势，尽管这并不显著。PI3 K与Siglec-15表达显著正相关（Pearson r = 0.54，p = .01）。作者将癌组织分为两组（Siglec-15高组和Siglec-15低组），并评估途径中关键基因的mRNA表达水平（附图S6b）。PI3 K在Siglec-15高组中高度表达（p < .05）。其他基因在Siglec-15高组中表达趋势较高，尽管这并不显著。
总结
总之，作者从多组学生物信息学的角度，研究了Siglec-15 mRNA的表达特征、预后价值、与肿瘤浸润免疫细胞的关系以及相关通路在各种癌症中的作用。作者进一步验证了Siglec-15表达与LUAD患者的不良预后和抑制性微环境相关。这些结果验证了Siglec-15表达在癌症预后和治疗中的重要性，并确定了进一步探索和确认的重要领域。
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